元龟二年（1571年）织田信长向足利义昭送上《十七条异见书》，痛斥其行为。元龟四年（1573年，同年改元天正）二月，足利义昭号召幕府臣子进入近江（今坚田城）、石山城起兵。明智光秀首次以织田信长的将领的身份对战前主足利义昭。在成功平定志贺郡足利义昭势力，稳住郡内的局势后，明智光秀攻入京都的上京，放火烧毁支援足利义昭的京内町众屋舍及寺社。最后在朝廷仲裁下双方停战议和。

天正元年（1573年），织田信长先后消灭朝仓、浅井家，并授命明智光秀为朝仓领地的代官赴越前就任。同年，一向宗发动暴动进攻越前，织田信长率3万余大军前往越前作战，光秀也随即出征。八月十五日夜里，明智光秀攻入龙门城，斩杀了本愿寺教众2000余人。由于镇压一向宗有功，明智光秀受封日向守，赐姓“惟任”。

天正三年（1575年）六月，织田信长写信给丹波国领主，要求他们配合明智光秀讨伐宇津家和内藤家。九月，明智光秀受命出兵丹波。十一月，明智光秀正式出兵天田郡黑井城。天正四年（1576年）正月十五日，由于盟友波多野秀治叛变，明智光秀的军队陷入孤立，被迫撤退，于正月二十一日回到坂本城。

天正五年（1577年），光秀在参与今福之战、天王寺之战、杂贺征伐战、信贵山城之战后，于十月十六日回到丹波，又成功夺取并占领了丹波龟山城（今京都府龟冈市）。然后明智光秀率军再次发起了平定战，同年占领了部分多纪郡，最终占领丹波东部至南部的大部分领土。天正七年（1579年）六月，明智光秀攻占八上城后成功平定了丹波。天正八年（1580年），织田信长把丹波一国册封给明智光秀，他的助将兼好友细川藤孝则得到丹后一国。

天正十年（1582年），织田信长命明智光秀返回坂本，准备盟友德川家康的招待事宜。据耶稣会传教士弗洛伊斯在他的《日本史》第五十六章中记载，正在准备宴会（接待家康）时，信长召明智于一密室议事，当明智感到不满提出谏言后，信长站起来怒不可遏，并两度用脚踢向明智。

当年五月十七日明智光秀本准备出征，二十六日他从坂本出发到中国，二十七日在爱宕山祭神祈愿，二十八日在威德院与里村绍巴等举行和歌会，作成了《爱宕百韵》。席间明智光秀询问本能寺护城河的深度，并在当日回到丹波龟山城。六月一日，明智光秀向部下透露了自己接下来的计划。

织田信长于天正十年（1582年）五月二十九日到达京都，下榻本能寺。六月一日晚，明智光秀率领1.3万人的军队从丹波龟山城出发向京都进军，于六月二日凌晨渡过桂川后，他向士兵们下达了向本能寺进攻的命令，正式决定背叛织田信长。本能寺守军不足百人，织田信长最终不敌而放火自尽，森兰丸为其殉死。之后，明智光秀立即进军京都，京都守备信长的长子织田信忠率部在京都妙觉寺转入二条御所与明智光秀奋战。不久，信忠自知不敌而切腹自尽，年仅26岁。明智光秀随后占领了胜龙寺、近江国的坂本城、安土城。

天正十年（1582年）六月三日至四日，明智光秀费力劝降诸方势力，尤其是希望细川藤孝和筒井顺庆加入己方，但多数织田家臣不齿光秀弑主的行为而纷纷拒绝，少数支持他的都是实力不成气候的小势力团体。六月五日，明智光秀进入安土城，期间为了收揽人心，他下令设立所司代，免除京都地区的地租，向寺院、神社捐赠金银，犒赏家臣士兵，将信长贮藏的金银财宝等名物分给家臣。七日，朝廷派敕使吉田兼和拜访光秀，维持京都地方的治安。九日，明智光秀正准备前往京都时接到了丰臣秀吉回师的消息，决定出兵山城国山崎（位于京都和大阪之间），由于丰臣秀吉快速行军提前赶到了山崎，致使明智光秀陷入被动。再加上织田信长威望高，明智光秀仓促反派准备不足，导致此前交好的细川藤孝、筒井顺庆等武将们都不肯与他共同进退，连明智光秀的与力、摄津国大名中川清秀和高山重友也倒向了丰臣秀吉。

是年六月十三日，明智光秀与丰臣秀吉、丹羽长秀、织田信孝等战于天王山（又称“山崎合战”）。开战后不久，由于高山、中川、池田三队的奋战，光秀军不敌逃至胜龙寺城（现在长冈京市胜龙寺）后打算前往坂本。根据丰臣秀吉记录的史料说，明智光秀经过山科小栗栖村时，有村民拦住光秀的去路，用竹枪杀死明智光秀，并斩取其首级，送到丰臣秀吉的军营获赏。

织田信长自幼在武士之家长大，精通兵法和武技。天文二十年（1551年）他在父亲去世后继承家业，经过东征西战于永禄三年（1559年）统一尾张。1568年，他拥护足利义昭进入京都就任室町幕府第15代将军，织田信长自己则掌握了实权。元龟元年（1570年），他采取各个击破的策略击败了浅井长政、朝仓义累、六角义贤等有力大名，又放逐了足利义昭。到本能寺之变发生前，织田信长已经成为日本最大的领主，他的事业也达到了顶峰，正在筹划统一日本全国。本能寺之变之后直到天正十八年（1590年），丰臣秀吉平定关东的后北条氏和奥羽地方后，才完成了日本全国的统一。

明智光秀发动“本能寺之变”，促使织田信长自杀身亡后，织田氏家臣集团随即分裂，织田各部军团长除了明智光秀身亡，其他主力大军编制内的士兵，成了各军团长的私兵。织田氏也因此分裂为北陆军团柴田胜家、关东军团泷川一益、山阳道军团羽柴秀吉（即此后的丰臣秀吉）、南海道军团神户信孝、若狭国主丹羽长秀。从属大名德川家康也趁机取得了独立。日本战国时代最强大的势力织田氏，也在同年讨论织田家继承人的清州会议之后四分五裂。织田信长过继出去的几个成年儿子，纷纷加入了对织田信长遗产的瓜分行动，使织田家的内部分裂进一步加剧。

织田信长因为过度沉迷于暴力未能成为日本的统治者，倒在了统一日本的前夕。丰臣秀吉凭借高超的军事、外交、政治才能让他吸收了原织田家中的大量实权大名、将领。天正十四年（1586年），丰臣秀吉政权确立，他正式成为天下第一人。丰臣秀吉试图以丰臣氏为主导，带领国内大名对外扩张，获得日本历史上前所未有的殊荣，进而使丰臣氏在日本国内取得超然的政治地位，还能将新征服的土地进行再分配，用来充实旧日部和丰臣直辖领，以弥补丰臣政权先天上的不足。

在江户、明治、大正3个时代到第二次世界大战后前，明智光秀的形象由于本能寺之变，饱受“忠逆思想”的批判。这期间的相关著作之中出现的明智光秀，都是出名的道德反面教材。例如丰臣秀吉在山崎之战后写下《惟任退治记》，就有贬抑明智光秀的形象。但在民间明智光秀的形象是正面的，比如光秀出生地每年都会举办“光秀祭”来纪念他。第二次世界大战后，日本的史学界从忠君观念中得到解放，重新对明智光秀进行理性的研究。日本战国史研究会初任会长高柳光寿在《明智光秀》一书中提及“信长与光秀理应是性格、想法相近的两个人，否则根本难以相处数十年”。

现代日本企业家松下幸之助评价认为，明智光秀是一个是相当杰出的人物，所以才受到信长的重用。然而，光秀由于看不惯信长的粗暴，所以在本能寺把主君信长杀了。这是他忤逆的个性决定的，也导致了他最后的失败。

根据吴座勇一《古代日本的战争与阴谋》记载，明智光秀把自己的母亲送到八上城作人质，换取波多野兄弟出降，但因织田信长不承认波多野的投降，又以为明智光秀拿普通老妇假扮自己母亲作人质而大怒。接着织田信长斩杀波多野兄弟，导致明智光秀的母亲也被八上城的士兵杀死。这也成为后世指称光秀怨恨信长的一个理由。

关于明智光秀的出身，最出名的说法是根据明他反叛织田信长之前所作的《爱宕百韵》，推测他是美浓国武家名门一源氏一脉的土岐氏支族明智氏的子孙。《立入宗继文书》里提到明智光秀是“美浓国住人，土岐之随分众也”。细川家在江户时代编纂的《细川家记》里提到明智光秀乃“清和源氏土岐下野守赖兼之后”。这两个史料支持了这个观点。著名史学家桑田忠亲在著书《明智光秀》中提到明智氏相关的家族谱系中没有明智光秀的名字，并且认为明智光秀出身土岐氏的说法有点武断。《武功杂记》说他曾一度出仕过三河国的牧野氏，《若州观迹录》则说他本是若狭国小滨城煅冶匠冬广的次男，和美浓明智氏完全没有关系。 学者胡炜权经过各类史料分析，认为明智光秀的家族是土岐氏一族长山明智家的庶出傍支，并且推测明智光秀很可能是长山明智赖明的后代。

日本历史作家桐野作人在《谁是本能寺之变首谋》中提出：明智光秀讨伐信长的最大动机，其实是阻止信长篡夺皇位的野心，与朝廷内的“反信长神圣同盟”订立密约的光秀，是勤王主义者。天文十年（1541年）和天文十二年（1543年）明智光秀负担了京内的皇宫的建筑费，因此受朝廷赐封“三河守”，并且朝廷为感谢信秀的慷慨和忠心，还派出连歌师宗牧到那古野城进行慰问，可以看出他与朝廷良好的关系。《威光寺文书》也记载有明智光秀认为“率土之滨，莫非王土”。而织田信长曾两度试图逼迫天皇退位，遭到正亲町天皇拒绝。但这个说法存在矛盾之处，根据《御汤殿上日记》中记载：到同年3月24日若天皇让位一旦决定，则“可喜可贺”；而《兼见卿记》则记载于4月1日转为中止。这可认为是织田信长最终并没有同意接受天皇的让位。正亲町天皇退位一事，应为朝廷方主动邀求，并希望织田信长出资，只是为织田信长所拒绝。

与明智光秀有相同血脉的明智宪三郎考据认为，当时织田信长在听取了有关国势中衰后，想要采取取道朝鲜、进入中国的战略。另外织田信长已经决定将明智光秀移封至南九州。作为织田信长接待外臣的要员之一的明智光秀一方面反对织田信长的占领，另一方面又于是产生了叛变的念头。

日本二战前的著名作家、记者、历史学家、评论家德富苏峰在《近世日本国民史》中最早指出，明智光秀对织田信长的强势心怀怨恨，同时作者也认为明智光秀怀有夺取天下的野心。日本史学家高柳光寿于1958年比较分析诸多史料后指出，本能寺之变的发生实因明智光秀希望夺得天下，成为新的“天下人”。认为“信长欲得天下，光秀亦同样欲得天下”。但高柳光寿的学生桑田忠亲在《明智光秀》一书中批评说，高柳光寿的这个观点是一种未能反映现实的，带有先入观念的学说。

怨恨说最初的出处可追溯至川角三郎右卫门的《川角太阁记》一书，后来江户时代初期的《续本朝通鉴》等史书中也有提及。该说法认为明智光秀怨恨织田信长的主要依据有，织田信长间接害死明智光秀的母亲、随意解除其职位、没收其领地、使用暴力打骂等。但查证史料，发现该说法很可能是江户时代编造出来的，可信度不高。

持此论者认为明智光秀并不是单独决定、意图杀死织田信长以得到天下，背后其实有势力或第三者与明智光秀合作，或者煽动、操控明智光秀以达到杀死织田信长的目的。主要有几种：日本史学家桐野作人提出的朝廷阴谋论说，认为织田信长与天皇存在矛盾，朝廷拉拢勤王派的明智光秀，并计划杀害织田信长；三重大学日本教育学系教授藤田达生提出的足利义昭阴谋论说，认为明智光秀没有放弃足利义昭幕臣的身份，在足利义昭的劝说下发动了本能寺之变；日本历史学者立花京子提出的耶稣会阴谋论说则认为，在耶稣会影响下明智光秀才发动本能寺之变；丰臣秀吉阴谋论说主要认为丰臣秀吉是事后乃第一个赶回近畿，并于山崎打败明智光秀的英雄，是整场事件的最终、最大得益者，可能是他推动的；德川家康阴谋论说认为德川家康与明智光秀及其家臣斋藤利三合谋杀害信长。这些阴谋论说法都停留在推测或假定的层面，均有不合理之处。

民间传说称明智光秀并没有死在小栗栖的树林中，而是隐遁了起来，后来成为德川家康的“智囊”天台宗大僧南光坊天海。还有另一说法丰臣秀吉在山崎、八幡之间的淀川河谷地带大败明智光秀军，明智光秀切腹自杀，而不是被村民杀害。